Carbon dots derivados da o-fenilenodiamina aplicados na captura de espécies reativas de oxigênio e como sensor de pH

Autores

Silva, L. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS) ; Calado, O. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS) ; Davi, L. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS) ; Almeida, J. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS) ; Silva, M. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS) ; Ferro, J. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS) ; Xavier, J. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS) ; Barbosa, C. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS)

Resumo

Os Carbon dots (CDs) são nanopartículas luminescentes de carbono que apresentam ampla aplicação, em especial na área de sensores. Nesse sentido, CDs foram sintetizados a partir da o-fenilenodiamina (CDs-oPD) via método hidrotermal a fim de avaliar seu potencial na detecção de pH e como agente antioxidante. Os CDs- oPD exibiram tamanho abaixo de 10 nm, bandas de absorções no UV-Vis ((transições π - π * (C=C) e n - π *(C=O/C-N)) e FTIR com vibrações características dos grupos de superfície dos CDs, além de emissão independente do comprimento de onda de excitação (λ_Exc) em 547 nm. Os CDs-oPD demonstraram viabilidade celular até 1000 µg/mL, boa sensibilidade ao pH na faixa 6 -12 e porcentagem de eliminação do ácido hipocloroso (HOCl), (72,3 ± 0,9 %).

Palavras chaves

Nanopartícula; Radicais livres; Sensor fluorescente

Introdução

Os carbon dots (CDs) são nanopartículas luminescentes de carbono que apresentam tamanho inferior a 10 nm. É formado por um núcleo grafítico e grupos de superfície característicos dos materiais utilizados na síntese, principalmente do precursor (Liu et. al., 2021; Ding et. al., 2020). Os CDs conseguem exibir excelentes propriedades óticas como fluorescência no espectro visível e possuem boa solubilidade, biocompatibilidade, fotoestabilidade, baixa toxicidade e sínteses de baixo custo (Tuerhong et. al., 2017; Yan et. al., 2019). Por esses motivos, os carbon dots têm contribuído em diversas aplicações, a exemplo de seu uso em bioimagem e na detecção de pH em amostras ambientais e biológicas (Yang et. al., 2019; Ehtesabi et. al., 2020). Trabalhos têm demonstrado que os CDs apresentam fluorescência dependente do pH capaz de torna-los ótimos nanomateriais para atuarem como sensores fluorescentes (Ehtesabi et. al., 2020). Omidi e colegas (2017) sintetizaram carbon dots a partir do citrato de amônio via método hidrotermal e obtiveram CDs com emissão em 462 nm independente do comprimento de onda de excitação. Esse material foi avaliado frente a variação de pH (4 a 10) e foi observado um aumento gradual na intensidade de fluorescência com o aumento do pH do meio (Omidi et. al., 2017). Em 2019, Yang e pesquisadores realizaram um estudo semelhante, em que foram produzidos CDs com emissão em 575 nm a partir do 1, 2, 4 - triaminobenzeno e ureia. A emissão apresentou ser dependente do pH, com aumento de intensidade do pH 4 ao 10 (Yang et. al., 2019). Em ambos os trabalhos, os carbon dots foram aplicados no monitoramento de cicatrização de feridas por meio da variação colorímetrica/fluorescente, porém não foram realizados estudos de viabilidade celular para garantir a biocompatibilidade do material. Para além das propriedades fluoresecentes, os CDs têm exibido potenciais aplicações como agente antioxidante na captura de espécies reativas de oxigênio (ROS) em sistemas biológicos (Huangfu et. al., 2021). Estudos nesse sentido são importantes pois várias doenças como as cardiovasculares e degenerativas são causadas pelo stress oxidativo das células devido a ação irregular de radicais oxigenados, a exemplo dos hidroxil (•OH), peroxil (ROO•), ânion superóxido (O2•˗) e algumas espécies que podem ser convertidas nesses radicais, como o ácido hipocloroso (HOCl), peróxido de hidrogênio (H2O2), etc (Apak et. al., 2022). Shen et. al (2017) sintetizaram carbon dots utilizando pomelo co- dopados com persulfato de amônio por um método hidrotermal e obtiveram nanopartículas com emissão máxima em 450 nm. A atividade antioxidante dos CDs foi avaliada utilizando os radicais DPPH, •OH e O2•˗, em que demonstraram bons resultados na captura de radicais, principalmente dos O2•˗ atingindo 81% na concentração de 700 μg/mL (Shen et. al., 2017). Nessa perspectiva, o trabalho buscou realizar estudos do efeito do pH e atividade de eliminação frente ao radical ânion superóxido (O2•˗) e ácido hipocloroso (HOCl) nos carbon dots obtidos da o-fenilenodiamina para futuras aplicações nas áreas biológicas e ambientais.

Material e métodos

Síntese dos Carbon dots (CDs-oPD) e estudo do efeito do pH: 20 mg de o- fenilenodiamina e 10 mL de água deionizada foram adicionados em um reator de teflon, revestido de aço inox, para procedimento hidrotermal por 4:30 h a 200 °C. Após, a solução contendo o CDs foi centrifugada a 15000 RPM/10 min e filtrada em membrana de 0,22 µm (Davi et. al., 2021). O CDs obtido foi denominado de CDs-oPD e armazenado em geladeira para posteriores análises. Os CDs foram caracterizados por espectroscopia de absorção no ultravioleta e visível (UV-VIS), infravermelho (FTIR) e fotoluminescência (FL). Ademais, foram utilizadas as técnicas de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) e microscopia eletrônica de transmissão (MET). O efeito do pH na FL foi realizado utilizando pH na faixa 2 ao 12 sob excitação em 385 nm. Viabilidade celular: Para o ensaio de viabilidade celular dos CDs-oPD foi utilizado o ensaio de MTT ((brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil tetrazolium])) em linhagem de fibroblastos de pele humana (HFF-1). As células foram mantidas em estufa de CO2/37º C em meio DMEM suplementado com SBF 15%, 100 µg/mL de penicilina e 100 U/mL de estreptomicina, acrescidos de 1,5 mM de L-glutamina. Para a realização do ensaio, 3,5 x103 células foram plaqueadas (DMEM/SBF5%) e mantidas em estufa por 20 h para sua adesão. Em seguida, foram tratadas com os CDs-oPD nas concentrações de 100, 500 e 1000 µg/mL durante 24h. Após o tempo de exposição, foi adicionado 23 µL de MTT (5 mg/mL) em todos os poços e a placa foi mantida em estufa por 3h e, em seguida, o sobrenadante foi descartado e 150 µL de DMSO/poço foi adicionado para a revelação dos cristais de formazan formados. Por fim, a leitura dos poços foi realizada no espectofotômetro em comprimento de onda de 540 nm, obtendo-se os valores de densidade óptica (DO) (Viabilidade (%) = (DO de células tratadas/DO de células não tratadas) × 100). Atividade de eliminação do radical ânion superóxido (O2•˗): A atividade de eliminação do O2•˗ foi realizada de acordo com Lucas et al. (2021). O ensaio consistiu na adição NADH (166 µM), NBT (43,3 µM), solução de CDs (100 - 800 µg mL-1 ) e PMS (2,7 µM). As medidas de absorbância foram realizadas em 560 nm a 37 ◦C em um leitor de microplacas (Infinite® 200 PRO, TECAN, Männedorf, Suíça). Atividade de eliminação do ácido hipocloroso (HOCl): A atividade de eliminação do HOCl foi realizada de acordo com Lucas et al. (2021). A solução de HOCl foi preparada na hora da análise, ajustando o pH de uma solução de NaOCl a 1% (v/v) para 6,2 com adição H2SO4. O sistema reacional consistiu na adição de tampão fosfato (100 mM, pH 7.4), solução de CDs-OPD (100 - 400 µg mL-1 ), solução de dihidrorodamina (DHR, 5 µM) e HOCl (5 µM). As medidas de fluorescência foram realizadas em um leitor de microplacas (Infinite® 200 PRO, TECAN, Männedorf, Suíça), a 37 °C, em comprimentos de onda de 505 ± 10 nm e 530 ± 10 nm, para excitação e emissão, respectivamente.

Resultado e discussão

As imagens de microscopia eletrônica de transmissão (MET) (figura 1 (a)) mostram que os CDs-oPD possuem estruturas quase-esféricas e grafítica (com espaçamento interplanar de 0,24 nm). O histograma de DLS também é representado na figura 1 (b) e indica que o tamanho da nanopartícula está distribuído principalmente em 3,8 nm, confirmando seu tamanho inferior a 10 nm (Liu et. al., 2021; Davi et. al., 2021). Uma vez que os grupos de superfície influenciam nas propriedades óticas dos CDs, o FTIR foi utilizado e seu espectro é mostrado na figura 1 (c). Em 3332 cm^-1 e 3217 cm^-1 são observados dois picos característicos de aminas primárias, associados as vibrações de deformação axial N-H. Em 1600 cm^-1 uma banda C=C de núcleo aromático também é detectada, relacionada a deformação axial da dupla ligação. Bandas C-N de aromáticos e N-H de deformação angular associada a ligação de cadeias aromáticas foram observadas em 1327 cm^-1 e 779 cm^-1, respectivamente (Davi et. al., 2021). Sugere-se, portanto, que os CDs-oPD tenham sido funcionalizados pelos grupos presentes na o-fenilenodiamina, uma vez que sua composição é rica em grupos nitrogenados (Ding et. al., 2020, Davi et. al., 2021). O espectro de absorção UV-Vis foi obtido (figura 1 (d)) e quatro bandas associadas as transições π - π * e n – π * dos CDs-oPD são visualizadas. Em 210 e 232 nm, bandas referentes a transição π - π * (C=C) do núcleo grafítico foram detectadas. Por outro lado, as bandas localizadas em 288 e 428 nm relativas a transição n – π * (C=O, C-N) foram observadas e possuem relação com os grupos presentes no material precursor (Ding et. al., 2017; Zhao et. Al., 2020) Uma vez que os carbon dots apresentam fluorescência na região do visível, a emissão dos CDs-oPD foi investigada pela técnica de fotoluminescência, variando o comprimento de onda de excitação (λ_Exc) entre 365 a 445 nm. O gráfico é representado na figura 1 (e) e a emissão dos CDs-oPD encontra-se centralizada em 547 nm, independente do λ_Exc, possuindo intensidade máxima sob excitação de 385 nm. Adicionalmente, o perfil independente dos CDs- oPD é claramente observado no diagrama de cromaticidade (figura 1 (f)) e está associado aos níveis de energia dos grupos de superfície, que favorecem sua emissão na região do verde independente da radiação utilizada (Reckmeier et. al., 2016; Ding et. al., 2020) Estudos preliminares foram realizados para avaliar o comportamento ótico dos CDs-oPD sob diferentes pH. A espectroscopia de fotoluminescência foi empregada para o estudo em questão e o gráfico obtido é representado na figura 2 (a). O espectro mostra que a intensidade de fluorescência dos CDs-oPD aumentou de forma gradual do pH 2 ao pH 6, quando atingiu seu máximo. Em valores mais elevados de pH (6 ao 12) a fluorescência passou a diminuir progressivamente, faixa na qual a curva apresentou melhor linearidade (I = 1107,31 -83,7 pH, R2 = 0,97). As imagens das soluções frente a variação do pH são demonstradas na mesma figura, bem como sua visualização em papel. Como a literatura sugere que as propriedades óticas dos carbon dots dependem de seus grupos de superfície, infere-se que quando o pH do ambiente em que os CDs se encontram é modificado, consequentemente a estrutura desses grupos podem sofrer alterações, afetando principalmente seu mecanismo de fluorescência (Omidi et. al., 2017; Yang et. al., 2019). Por ser um estudo recente, pesquisadores utilizam alguns mecanismos para interpretar a sensibilidade dos carbon dots ao pH, que pode estar relacionada a mudança no estado de energia, agregação dos CDs, protonação/desprotonação, transferências de prótons, etc (Liu et. al., 202; Ehtesabi et. al., 2020). Buscando assegurar a aplicação dos CDs-oPD como sensor de pH em sistemas biológicos e ambientais, um estudo de interferência na viabilidade celular foi realizado utilizando uma linhagem de fibroblastos não tumorais de pele humana (HFF-1). A figura 2 (b) mostra que os CDs-oPD mantiveram a viabilidade das células HFF-1 superior a 80% nas 3 concentrações testadas. Os resultados obtidos corroboram com a literatura quando atribuem de forma geral uma baixa citotoxicidade dessa classe de nanopartícula para vários tipos de células (Vale et. al., 2021; Roy et. al., 2022). Ademais, os CDs-OPD apresentaram excelente potencial de eliminação de HOCl nas concentrações testadas, com mais de 50 % de captura na menor concentração avaliada que foi de 100 µg mL-1 (figura 2 (c)). No entanto, quando testado frente ao O2•˗, o tratamento com os CDs-OPD não apresentou qualquer efeito de eliminação mesmo aumentando a concentração até 800 µg mL-1. Os resultados sugerem que esses CDs reagem seletivamente com espécies reativas de importância biológica (Shen et. al., 2017).

a) Microscopia eletrônica de transmissão e b) DLS. Espectros de c) FTIR, d) UV-Vis, e) fotoluminescência e f) coordenada de cor dos CDs- oPD.


a) Fotoluminescência e fluorescência em solução e papel nos diferentes pH, b) viabilidade celular e c) porcentagem de eliminação de HOCl dos CDs-oPD

Conclusões

Os carbon dots obtidos a partir da o-fenilenodiamina (CDs-oPD) por método hidrotermal apresentaram tamanho menor que 10 nm e grupos nitrogenados de superfície, além de excelentes propriedades óticas com emissão em 547 nm. Os CDs estudados se mostraram viáveis em células de fibroblastos não tumorais de pele humana (HFF-1), exibindo boa viabilidade celular até concentrações de 1000 µg/mL. Os diferentes pH (2 a 12) alteraram a intensidade de fluorescência dos CDs-oPD, o qual exibiu faixa linear do pH 6 – 12. Por fim, esse estudo é de grande relevância, pois proporciona um método simples para produção de CDs com ótimas possibilidades de aplicações na detecção de pH em sistemas biológicas e ambientais, bem como sequestrador de espécies reativas de oxigênio importantes em alguns processos específicos das áreas supracitadas.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao apoio financeiro da CAPES, UFAL, CNPq e FAPEAL e ao laboratório multiusuário de microscopia de alta resolução (LabMic/UFG)

Referências

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