Determinação de fosfato, tetrapirofosfato e tripolifosfato por eletroforese capilar com detecção condutométrica sem contato.

Autores

Rocha, K.N. (UNICAMP) ; Barboza, L.J. (UNICAMP) ; Faria, L.M. (UNICAMP) ; Jesus, D.P. (UNICAMP)

Resumo

O presente trabalho tem como objetivos verificar a viabilidade de um método analítico empregando Eletroforese Capilar com detecção C⁴D, para a determinação de ânions fosfato, tetrapirofosfato e tripolifosfato. Foram utilizadas soluções padrão dos três sais e como eletrólito o ácido acético. As análises foram realizadas nas seguintes condições experimentais: Eletrólito de corrida ácido acético 0,5 mM, tempo de injeção hidrodinâmica de 5 s, tensão de separação de -25 kV, detecção C4D operando em 600 kHz e 4V de amplitude. A partir de alguns parâmetros analíticos foi possível constatar a viabilidade do método proposto, com boa linearidade e altos valores de recuperação. Desta forma, o método pode ser aplicado ou adaptado para determinação destes ânions em outras amostras.

Palavras chaves

Eletroforese Capilar; C4D; Ânions fosfatos

Introdução

Os ânions fosfato (PO₄^3-), tetrapirofosfato (P₂ O₇^4-) e tripolifosfato (P₃O₁₀ ^5-) desempenham papéis fundamentais em processos bioquímicos, tais como a participação do pirofosfato na replicação do DNA e também a transdução de energia envolvendo métodos bioenergéticos e metabólitos (KIM, 2013). Entretanto, em altas concentrações, o pirofosfato pode provocar diversas doenças relacionadas às articulações, como a artrite dolorosa (HSU, 2021; ROSENTHAL, 2016). Além disso, os fosfatos contribuem consideravelmente para o processo de eutrofização (ANBU, 2021; SCHINDLER, 2016), este que representa crescimento excessivo e prejudicial de algas em corpos hídricos devido ao enriquecimento dos mesmos com nutrientes como o fósforo, sendo os esgotos domésticos um dos principais geradores deste problema devido ao uso de detergentes com derivados de fosfatos em abundância em sua composição. Dentre as diversas técnicas adotadas para a determinação desses ânions, a eletroforese capilar (EC) apresenta certas características que favorecem à sua escolha com relação às outras, como a demanda de curto tempo para análise, alta eficiência, alta resolução e a utilização de baixos volumes de amostra para análise. Basicamente, a EC consiste em um método de separação baseado na diferença da velocidade de migração de espécies carregadas, a partir de uma solução eletrolítica, através da qual tenha sido aplicado um campo elétrico de corrente contínua (TAVARES, 1996). Neste trabalho, a eletroforese capilar foi utilizada pela primeira vez com a detecção condutométrica sem contato (CE- C⁴D) em um método analítico para a determinação de ânions fosfato, tetrapirofosfato e tripolifosfato.

Material e métodos

Soluções padrão de tripolifosfato, fosfato e tetrapirofosfato de sódio foram preparadas a partir da solubilização do respectivo sal em água deionizada (ultrapura). Para as separações por CE-C⁴D foi utilizado um equipamento montado no próprio laboratório (homemade) com a detecção C⁴ D operando em uma frequência de 600 kHz e amplitude de 4V. As separações foram conduzidas em uma coluna capilar de sílica fundida, recoberta por poliamida, com comprimento total de 40 cm (38 cm efetivo) e diâmetro interno de 50µm. Uma etapa de condicionamento do capilar foi realizada com lavagens (flush) consecutivas de solução de ácido clorídrico 0,1 mmol L^-1 por 10 minutos, água deionizada por 2 minutos; e ácido acético (BGE, background electrolyte) 0,5mol L^-1 por 10 minutos. O potencial de separação foi de -25 kV e a injeção hidrodinâmica de amostra foi realizada pelo tempo de 5s. Para a obtenção da curva de calibração, foram preparadas cinco soluções diluídas, a partir das soluções estoques, nas seguintes concentrações: 50, 100, 200, 300 e 400 µmol L^-1. As amostras de água de torneira foram injetadas, sem necessidade de etapa de preparo. A exatidão do método foi avaliada via testes de recuperação em triplicatas com adição (fortificação) dos fosfatos (200 µmol L^-1, cada) em amostras de água de torneira. O C⁴D, consiste em dois eletrodos que circundam o capilar, formando uma lacuna de detecção de ~1 mm. Ao aplicar uma frequência de oscilação, ocorre uma transição capacitiva entre o eletrodo atuador e o líquido dentro do capilar. Após a transição capacitiva passar pelo intervalo de detecção, ocorre uma segunda transição capacitiva entre o eletrólito e os eletrodos de captação(ZEMANN, 2003).

Resultado e discussão

A Figura 1 mostra o eletroferograma obtido de uma mistura contendo tripolifosfato, tetrapirofosfato e fosfato em uma concentração de 500 µmol L^-1 (cada). O primeiro pico é atribuído ao tripolifosfato com tempo de migração cerca de 1,5 minuto, seguido de tetrapirofosfato e fosfato em 2,2 e 5,0 minutos, respectivamente. As condições de separação e o eletrólito de corrida escolhidos permitiram uma separação com boa seletividade e eficiência (resolução de picos) em um tempo curto (5min), que é um ponto característico da eletroforese capilar. A C⁴D demonstrou ser adequada para a detecção direta de fosfatos, o que não seria possível empregando detectores convencionais (comerciais) utilizados em CE, os quais geralmente dependem de absorção de radiação pelos analitos. A fim de verificar a viabilidade do método analítico na determinação de ânions fosfatos em água, o mesmo foi aplicado em amostras de água de torneira e posteriormente determinados alguns parâmetros analíticos como pode ser observado na Tabela 1. Como pode ser constatado, boa linearidade e altos valores de recuperação (próximos a 100%) foram obtidos, demonstrando a viabilidade de aplicação do método analítico para a determinação dos ânions tripolifosfato, tetrapirofosfato e fosfato em amostras de água.

Eletroferograma de uma solução contendo tripolifosfato, tetrapirofosfato e fosfato (500 µmol L-1, cada).


Parâmetros analíticos para o método proposto em análise de amostras de água de torneira.

Conclusões

Pela primeira vez foi demonstrada a viabilidade de um método analítico empregando Eletroforese Capilar com detecção C4D para a determinação dos ânions fosfatos, tetrapirofosfato e tripolifosfato em amostras de água. Desta forma, o método proposto pode ser aplicado em estudos ambientais ou adaptados para determinação destes ânions em outras amostras, tais como detergentes (soluções ou em pó).

Agradecimentos

À FAPEMA, CAPES, FAPESP, CNPq, SAE-UNICAMP e INCT-Bio.

Referências

ANBU, S. et. al. Differentially Selective Chemosensor with Fluorescence Off–On Responses on Cu2+ and Zn2+ Ions in Aqueous Media and Applications in Pyrophosphate Sensing, Live Cell Imaging, and Cytotoxicity. Inorganic Chemistry, v. 53, n. 13, 6655-6664, 2014.

HSU, V. M. et al. Inorganic pyrophosphate is reduced in patients with systemic sclerosis. Rheumatology, 1158-1165, 2021.

KIM, S. et al. A highly sensitive gold nanoparticle-based colorimetric probe for pyrophosphate using a competition assay approach. Chem. Commun, v. 49, n. 2, 152-154, 2013.

ROSENTHAL, A. K.; RYAN, L. M. Calcium Pyrophosphate Deposition Disease. New England Journal Of Medicine, v. 374, n. 26, 2575-2584, 2016.

SCHINDLER, D. W. et al. Reducing Phosphorus to Curb Lake Eutrophication is a Success. Environmental Science & Technology, v. 50, n. 17, 8923-8929, 2016.
Tavares, M. F. M. Eletroforese Capilar: Conceitos Básicos. Química Nova, 19 (2), 173–181, 1996.

ZEMANN, A. J. Capacitively coupled contactless conductivity detection in capillary electrophoresis. Electrophoresis, v. 24, 2125-2137, 2003.