Autores
Oliveira, B.N. (UFAL) ; Santos, J.C. (UFAL) ; Nascimento, A.L.A. (UFAL)
Resumo
O ácido ascórbico (AA) é uma vitamina hidrossolúvel de grande importância nos
processos fisiológicos devido a sua elevada capacidade antioxidante associada à
prevenção de várias doenças. Assim, foi desenvolvido um método explorando a
utilização de um dispositivo baseado em papel (PAD) para determinação de ácido
ascórbico considerando a reação do azul da Prússia (AZP). As imagens foram
digitalizadas em um scanner e a análise realizada no software Corel Photo Paint™
X7, sendo o canal de cor ciano o de maior sensibilidade. Neste sentido, as
condições reacionais do método foram otimizadas visando à aplicabilidade no PAD
quanto à máxima sensibilidade analítica, além de ser um sistema de resposta
rápida, simples e de baixo custo com possibilidade de aplicação em diferentes
amostras.
Palavras chaves
ácido ascórbico; dispositivo em papel; detecção colorimétrica
Introdução
O ácido ascórbico é uma vitamina hidrossolúvel que desempenha um papel
importante para sistemas bioquímicos, farmacológicos, e no processamento de
alimentos como antioxidante (LI, ZHOU e DU, 2022) e além disso, está presente
naturalmente em frutas e vegetais. Considerando que o ácido ascórbico (AA) é
relativamente instável a depender das condições de armazenamento e processamento
(CHEN et al., 2010), torna-se necessário o desenvolvimento de metodologias para
determinação deste levando em consideração a natureza da amostra, bem como, o
nível de concentração. De forma geral, existem diversos métodos instrumentais
para determinação de AA explorando detecção espectrofotométrica, eletroquímica,
por fluorescência molecular, assim como, métodos cromatográficos devido a
importância desta molécula no metabolismo humano (EL-MALLA, 2022). Contudo,
estes métodos apresentam desvantagens de usar grandes volumes de reagentes, em
alguns casos pode ser demorados, e o preparo da amostra pode induzir a variações
(superestimação ou subestimação) do conteúdo de AA. Neste contexto, o objetivo
do trabalho foi avaliar um dispositivo point-of-care (POC) para quantificação
colorimétrica de ácido ascórbico utilizando a reação de formação do Azul da
Prússia (AZP), um ensaio qualitativo clássico para detectar Fe(II) usando
hexacianoferrato(III) como reagentes (NOBREGA e LOPES, 1995). O emprego de
dispositivos analíticos baseados em papel (PAD) consiste em usar um material
acessível, versátil, portátil e de baixo custo para aplicação em sistemas
microfluídicos, após a confecção de microzonas delimitados por uma barreira
hidrofóbica, na qual a reação leva a alteração de alguma propriedade (como a
cor, por exemplo) ocorre após adição de microlitros de reagentes e amostra
(NAMWONG et al., 2018). Os PAD com detecção colorimétrica são extremamente
atrativos, baseados na alteração da cor após o processamento de uma reação
química, e podem ser usados de forma rápida para alcançar respostas qualitativas
ou quantitativas. Portanto, é possível monitorar a coloração de forma visual
para respostas qualitativas binárias (sim ou não) ou usando sistemas de captura
eletrônica como scanners, câmeras digitais e smartphones para obter a
intensidade da cor (MORBIOLI et al., 2017). Dessa forma, objetiva-se o
desenvolvimento de um método simples, rápido, de fácil implementação com
reagentes amplamente disponíveis, além de apresentar reprodutibilidade,
sensibilidade para diferentes amostras e que esteja em consonância com os
princípios da química verde.
Material e métodos
Para determinação de ácido ascórbico empregando papel como plataforma analítica
foram avaliados os principais parâmetros experimentais de forma univariada para
obter a melhor sensibilidade: (i) ordem de adição dos reagentes (A: AA → FeCl3
→ K3[Fe(CN)6, B: AA → K3[Fe(CN)6 → FeCl3, C: FeCl3 → AA → K3[Fe(CN)6 , D:
K3[Fe(CN)6 → AA → FeCl3; (ii) adição do polímero polivinilpirrolidona (PVP 10%
m/v); (iii) variação na concentração do FeCl3 (5; 7,5; 10 µM) e (iv) variação na
concentração do K3[Fe(CN)6] (5; 7,5; 10 µM). Com exceção do PVP preparado em
água, as demais soluções foram preparadas em ácido nítrico 0,45 M. O ácido
ascórbico na forma reduzida (AAr) reage com os íons Fe(III) levando a formação
de Fe(II) e ácido ascórbico oxidado (AAo), assim, os íons Fe(II), os quais ao
reagirem com K3Fe(CN)6 levam a formação do corante azul da Prússia (AZP). O
método proposto consistiu na utilização do dispositivo analítico baseado em
papel (PAD) produzido pela técnica de impressão em cera (CARRILHO, 2009). O
layout foi desenhado usando o software Corel Draw™ versão X8, impresso em papel
cromatográfico, e em seguida, aquecido a 110°C por 2 min para derreter
completamente a cera, gerando barreiras hidrofóbicas eficazes no substrato de
papel (TAVARES, 2021) . Por último, um lado do dispositivo de papel foi
revestido com fita adesiva para evitar vazamento da amostra. Assim, cada
solução foi adicionada nas microzonas circulares de detecção do PAD, sendo
necessário um tempo de 5 min entre a adição de cada solução reagente no papel e
a secagem homogênea a temperatura ambiente (25°C), totalizando 20 min. Após a
etapa de secagem, as imagens foram adquiridas por digitalização (scanner), e a
intensidade de cor nos canais de cores ciano, magenta, amarelo e preto (CMYK)
foi analisada com o software Corel Photo Paint™ X7. Por fim, foram construídas
curvas analíticas considerando o intervalo de concentração do ácido ascórbico (0
a 1500 µM).
Resultado e discussão
Inicialmente analisou a ordem de adição das soluções buscando a melhor resolução
de cor na zona de detecção, desta forma, foram avaliadas quatro ordens de adição
das soluções (A-D). A ordem de adição C e D apresentaram a maior sensibilidade
analítica (Fig. 1A), pois, a redução da espécie de Fe(III) a Fe(II), é mais
eficiente comprado as ordens A e B. Contudo, a ordem de adição D (K3[Fe(CN)6 →
AA → FeCl3) foi selecionada pois apresentou melhor homogeneidade na zona de
detecção. Dentre os sistemas de cores disponíveis, optou-se por avaliar o de
cores subtrativas CMYK formado por ciano, magenta, amarelo e preto caracterizado
pelo sistema cor pigmento reproduzindo a maioria das cores do espectro visível.
O canal ciano apresentou os melhores resultados quanto a sensibilidade para a
reação (Fig. 1B), possivelmente devido ao produto formado possuir coloração
azul, por consequência, esse canal foi selecionado para os demais ensaios. Em
seguida, com o intuito do sistema adquirir maior sensibilidade foi avaliada a
influência da polivinilpirrolidona (PVP), para modificar a superfície do papel,
em duas ordens, (1) PVP → K3[Fe(CN)6 → AA → FeCl3 e (2) K3[Fe(CN)6 → AA → FeCl3
→ PVP (Fig. 1C). Este procedimento levou ao aumento da sensibilidade em relação
ao sistema sem adição do polímero, sendo que a ordem (1) foi a escolhida pois
promoveu a dispersão do pigmento colorido de forma homogênea na zona de
detecção. Os volumes de cada solução adicionada influenciam o tempo de secagem,
e desta forma, o tempo total de análise, assim como em alguns casos a
sensibilidade analítica. Dessa forma, os volumes de todas as soluções foram
avaliados simultaneamente em experimentos independentes. Em geral, a
sensibilidade analítica empregando 1,0 e 1,5 μL dos reagentes não apresentou
diferença significativa, contudo o volume de 2,0 μL foi selecionado uma vez que
permitiu uma maior sensibilidade analítica e baixo erro instrumental, contudo
para o PVP manteve-se o volume de 1,0 μL, uma vez que este parâmetro não mostrou
influência na sensibilidade. Além disto, valores superiores a 2,0 μL foram
testados ocasionando um maior tempo de secagem e redução apreciável da
linearidade do método. Em relação ao tempo total de reação, aproximadamente 20
min foi suficiente para ter-se a intensidade máxima do sinal. A concentração dos
reagentes colorimétricos, no caso FeCl3 e Fe(CN)6 foram avaliadas no intervalo
de 5,0 a 10 µM. No processo de otimização a concentração dos reagentes FeCl3
(Fig 1D) e K3[Fe(CN)6] (Fig 1E) mostrou perfil quanto a sensibilidade analítica
similar, desta forma, a concentração de 5 µM para ambos os reagentes foi
selecionada, uma vez que levaram a melhor homogeneidade e intensidade da cor na
zona de detecção. Fig 1. (A) Ordem da adição dos reagentes (AA, FeCl3 e
Fe(CN)6); (B) Faixa linear de intensidade de cor nos diferentes canais CMYK; (C)
Influência do PVP e variação da sensibilidade (gráfico interno) em cada ordem
aplicada; (D) Variação da concentração de FeCl3 em função da concentração de AA;
(E) Variação da concentração de Fe(CN)6 em função da concentração de AA; Por
fim, o método será aplicado em amostras comerciais e de alimentos e comprado a
metodologia de referência para validação.
Conclusões
A aplicação de um dispositivo analítico em papel com detecção colorimétrica
mostrou-se eficiente para a determinação de ácido ascórbico em até 20 min. No
processo de otimização diferentes parâmetros foram avaliados visando se obter
maior sensibilidade. As mudanças da intensidade de cor foram proporcionais ao
aumento da concentração de AA em concordância com outros ensaios colorimétricos
descritos na literatura. Além disso, cabe ressaltar a necessidade de continuidade
do estudo para minimizar o erro associado desenvolvendo novas abordagens do método
que possuem vantagens como praticidade, custo-benefício e portabilidade, e por
fim, aplica-los em amostras reais.
Agradecimentos
UFAL, IQB, PPGQB, FAPEAL, CNPq, CAPES
Referências
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CHEN, H., LI, R., LIN, L., GUO, G. and LIN, J.M., 2010. Determination of l-ascorbic acid in human serum by chemiluminescence based on hydrogen peroxide–sodium hydrogen carbonate–CdSe/CdS quantum dots system. Talanta, 81(4-5), pp.1688-1696.
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