Autores
Arrieche, D. (UNIVERSIDAD TECNICA FEDERICO SANTA MARIA) ; Carrasco, H. (UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHILE) ; Pardo, J. (BIORESTAURACION CONSULTORES) ; Jara-gutierrez, C. (UNIVERSIDAD DE VALPARAISO) ; Villena, J. (UNIVERSIDAD DE VALPARAISO) ; Taborga, L. (UNIVERSIDAD TECNICA FEDERICO SANTA MARIA)
Resumo
En este estudio se analizó la actividad citotóxica de los extractos etanólicos de
las partes aéreas (FE1) y frutos (FE2) de Pintoa chilensis. La actividad
citotóxica mostró que FE2 fue mucho más activa contra la línea celular MCF-7,
mostrando poca o ninguna actividad contra la línea celular MCF-10A. La producción
de ROS, lipoperoxidación y los cambios en el potencial de la membrana mitocondrial
en la línea MCF-7 inducida por FE2 posiblemente promueven la muerte celular
mediante apoptosis. Por el contrario, en la línea celular MCF-10A el extracto FE2
posiblemente esté actuando como un agente antioxidante. Con estos resultados se
procederá al aislamiento de los metabolitos secundarios presentes en la fracción
de diclorometano que posiblemente sean los responsables de la actividad.
Palavras chaves
Actividad citotóxica; Extracto etanólico; Pintoa chilensis
Introdução
La búsqueda de compuestos selectivos contra el Cáncer en los últimos años se ha
incrementado debido a que es una enfermedad que causa un gran número de muertes
a nivel mundial, siendo en Chile la principal causa de muerte (Nivetha et al.,
2019). Los estudios en el área del cáncer en las últimas décadas han provisto
importantes herramientas para el tratamiento de esta (Baudino et al., 2015). Los
productos naturales derivados de plantas han mostrado resultados prominentes
contra las células cancerígenas presentándose como potentes agentes
anticancerígenos ya que muchos de estos productos no son tóxicos para las
células humanas normales por lo que estos pueden pasar a ensayos clínicos para
desarrollos terapéuticos adicionales (Cragg et al., 2018). Los extractos de
plantas se han utilizado durante muchos años para tratar muchas infecciones y
enfermedades debido a la abundancia de metabolitos secundarios: cumarinas,
alcaloides, flavonoides, etc., que muestran importantes actividades biológicas
(Garbarino et al., 2007). Por otro lado, organismos vegetales que habitan en
ambientes extremos como el Desierto de Atacama, han desarrollado una gran
variedad de adaptaciones: fisiológicas, genéticas, metabólicas, que se traducen
en la formación de metabolitos secundarios con estructuras químicas únicas y
mecanismos de acción novedosos (Tian et al., 2017). Pintoa chilensis es una
especie de planta monotípica y endémica del norte de Chile. Hasta la fecha no se
han reportado estudios relacionados con el aislamiento de metabolitos
secundarios y sus actividades biológicas. En este trabajo se muestra los
resultados de la actividad citotóxica del extracto etanólico, así como de las
fracciones obtenidas de las partes aéreas y de los frutos de esta planta.
Material e métodos
Las partes aéreas (FE1) y frutos (FE2) de P. chilensis Gay fueron recolectadas
en la localidad de Copiapó, provincia de Atacama, Chile. El material seco fue
puesto a macerar en una mezcla de etanol-agua (70:30), en agitación constante
durante 96 horas a una temperatura de 25ºC y 1500 rpm, utilizando un shaker
incubador. Una vez obtenido el extracto etanólico, se realizó una extracción
exhaustiva por medio de un sonicador, durante 1 hora a una temperatura entre 45-
50ºC en tres períodos. La mezcla resultante fue filtrada y el solvente eliminado
a presión reducida por medio de un rotavapor y el agua fue eliminada por medio
de un liofilizador, obteniendo así el extracto etanólico sólido (FE1 sólido
negro viscoso y FE2 sólido gris). Una vez obtenido el extracto etanólico se
realizó un screening fitoquímico cualitativo siguiendo el protocolo de Harbone
(Harbone, 1998), con el fin de poder determinar el contenido fitoquímico
presente en los extractos. Así mismo, se procedió a realizar un estudio de
viabilidad celular de los extractos utilizando el método colorimétrico de la
Sulforodamina B sobre las líneas celulares de cáncer tumorales: MCF-7 (Cáncer de
mama) y HT-29 (Cáncer de colon), así como sobre la línea control no tumoral MCF-
10A (Célula epitelial humana) (Vichai y Kirtikara, 2006). Adicionalmente, con el
extracto que presentó mayor actividad citotóxica se procedió a determinar el
cambio en la permeabilidad de la membrana mitocondrial, lipoperoxidación, ROS y
caspasas activas mediante citometría de flujo. Finalmente se realizó un
fraccionamiento líquido-líquido con el fin de obtener fracciones de diferentes
polaridades y poder determinar la viabilidad celular de los mismos para
continuar con el aislamiento y caracterización química de los metabolitos
secundarios.
Resultado e discussão
Los extractos etanólicos fueron obtenidos con rendimientos de 43,8% y 30,45%
para FE1 y FE2, respectivamente. La actividad citotóxica de los extractos fue
evaluada mostrando que FE1 fue menos activo, mientras que FE2 fue mucho más
activa contra la línea celular MCF-7, mostrando poca o ninguna actividad contra
las otras líneas celulares estudiadas. El índice de selectividad fue
determinado, mostrando que para FE2 fue mayor a 1,8 por lo que es más citotóxico
para MCF-7 que para MCF-10A. La cuantificación de los niveles de ROS y
lipoperoxidación mostraron un incremento para MCF-7, de manera contraria se
observó una disminución en la producción de ROS y lipoperoxidación en MCF-10A,
en comparación con el control positivo utilizado. Por otro lado, se observó una
disminución en el potencial de la membrana mitocondrial de MCF-7, mientras que
el de MCF-10A permaneció intacta y una disminución de la determinación de
caspasas activas en la línea MCF-7, comparada con el control positivo. Se
realizó una separación líquido-líquido del extracto etanólico de FE2 con el fin
de obtener fracciones de diferentes polaridades: fracción de hexano (FH),
fracción de diclorometano (FD), fracción de acetato de etilo (FA) y la fracción
residual de agua (FQ). La viabilidad celular de éstas fue evaluada, observando
que FH presentó mayor efecto citotóxico sobre las dos líneas celulares
estudiadas. Sin embargo, FD fue más selectiva sobre la línea celular MCF-7, en
tanto que FA presentó valores de IC50 similares para ambas líneas celulares. Con
estos resultados se procederá al aislamiento de los metabolitos secundarios
presentes en FD la cual presentó cierta selectividad sobre la línea MCF-7, ya
que posiblemente los metabolitos presentes en esta fracción sean los
responsables de la actividad citotóxica
Conclusões
La producción de ROS, lipoperoxidación y los cambios en el potencial de la
membrana mitocondrial en la línea MCF-7 inducida por FE2 posiblemente promueven la
muerte celular. Por el contrario, en la línea celular MCF-10A el extracto FE2
posiblemente esté actuando como un agente antioxidante. Se esperaba un incremento
en la determinación de caspasas activas que confirmaría el mecanismo de apoptosis
celular. Sin embargo, se observó una disminución, lo que nos lleva a pensar que el
mecanismo de apoptosis celular ocurre por una vía distinta a la activación de
caspasa.
Agradecimentos
• Dr. Joan Villena y Dr. Carlos Jara-Gutierrez por la ayuda con los ensayos
de citotoxicidad.
• Ing. Javier Pardo Baeza por la recolección del material vegetal.
• A la USM, UV y ANID por el financiamiento otorgado.
Referências
• Baudino, T.A. Targeret Cancer Therapy: the next generation of cancer treatment. Current Drug Discovery Technologies, 12, 3 – 20, 2015.
• Cragg, M.G.; Newmann, D.J. Natural Products as sources of Anticancer Agents: Current Approaches and Perspective. In Natural Products as Source of Molecules with Therapeutic Potential. Springer Nature Switzerland, 2018.
• Garbarino, J.A.; Cardile, V.; Lombardo, L.; Chamy, M.C.; Piovano, M.; Russo, A. Demalonyl Thyrsiflorin A, a semisynthetic labdane-derived diterpenoid, induces apoptosis and necrosis in human epithelial cancer cells. Chemico-Biological Interactions, 169, 198 – 206, 2007.
• Harbone, J.B. Phytochemical Methods. A guide to modern technique of plant analysis. 3rd Edition, Chapman and Hill, London, 285, 1998.
• Nivetha, X.R.; Jeba-Soundari, M.J.; Muthukumar-Nadar, M. S. A.; Premmath, D.; Selvakumar, M. P. M; Chang, R. An Insight into cancer and anticancer drugs. Acta Scientific Medical Sciences. 3 (8), 32 – 43, 2019.
• Tian, Y.; Li, Y. L.; Zhao, F. C. Secondary Metabolites from Polar Organisms. Marine Drugs. 15, 28, 2017.
• Vichai, V.; Kirtikara, K. Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity screening. Nature Protocols. 1(3): 1112 – 1116, 2006.
