Frações de extrato cetônico de folhas de Mimosa caesalpiniifolia com atividade anti-helmíntica

Palavras chaves

Mimosa caesalpiniifolia; anti-helmínticos; compostos fenólicos

Introdução

Apesar dos avanços na pecuária intensiva, a grande incidência de nematoides gastrointestinais continuam a ser uma das principais causas de doenças, redução de produção e perdas econômicas na ovinocaprinocultura (SOARES; WANDERLEY; COSTA JUNIOR, 2019). Os ovinos e caprinos têm papéis econômicos importantes em regiões de climas tropicais e subtropicais, sendo que a combinação de altas temperaturas e chuvas nessas áreas fornece um ambiente propício para o desenvolvimento de nematoses (JACKSON; VÁRADY; BARTLEY, 2012; WALLER, 1997). Essas nematoses prejudicam a deposição de tecido e a produção animal, com perdas variando entre regiões, anos, estações e eficácia das medidas de controle (BESIER et al., 2016; PARKINS; HOLMES, 1989). O tratamento depende quase exclusivamente da quimioprofilaxia usando um número limitado de drogas anti-helmínticas sintéticas comercialmente disponíveis (GARCÍA et al., 2018; OLIVEIRA et al., 2011). Todavia, esses produtos tem impactado negativamente no meio ambiente e na saúde dos hospedeiros (SALGADO; SANTOS, 2016). Além disso, seu uso contínuo e, por vezes, indiscriminado tem acarretado na seleção de parasitos resistentes o que acaba por reduzir drasticamente a eficiência dessas drogas (ŠIMPRAGA et al., 2015). Por conseguinte, abordagens alternativas tem sido investigadas com o objetivo de alcançar compostos de alta eficiência, com menor impacto ambiental e seguro para os animais (SOARES; WANDERLEY; COSTA JUNIOR, 2019). Nessa perspectiva, compostos do metabolismo secundário de plantas têm sido apontados como promissores ativos para o tratamento de infecções parasitárias (WINK, 2012). Dentre esses, destacam-se os taninos que são tipicamente classificados como taninos hidrolisáveis, condensados e florotaninos. Taninos causam redução na carga parasitária, na excreção de ovos nas fezes e na fecundidade dos parasitos (ENGSTRÖM et al., 2016; OLIVEIRA et al., 2011; PAOLINI et al., 2003). Flavonoides, ácidos fenólicos e outros compostos fenólicos também já demonstraram ter atividade anti-helmíntica em diferentes estágios do ciclo de vida de nematoides (GAO et al., 2018; KLONGSIRIWET et al., 2015; NDJONKA et al., 2014). Os taninos condensados são os compostos fenólicos mais estudados para fins teraupeuticos, por conta disso a Mimosa caesalpiniifolia Benth, que possui uma alta concentração de taninos condensados nas folhas e caule, está entre as plantas apontadas com capacidade repositória de notórios anti- helmínticos (BRITO et al., 2017). Essa planta, conhecida popularmente como “sabiá”, pertence a família Leguminosae e é caracterizada por rápido crescimento, alta capacidade de regeneração e resistência à seca (PODADERA et al., 2015). Já foi demonstrado in vitro a atividade anti-helmíntica do extrato cetônico de suas folhas contra importantes nematoides gastrointestinais (BRITO et al., 2017). Além disso, Brito et al. (2018), observou diminuição da carga parasitária de vermes adultos de Haemonchus contortus, a espécie de nematoide gastrointestinal de pequenos ruminantes mais patogênica e economicamente importante, em caprinos que receberam taninos condensados de M. caesalpiniifolia. Diante deste cenário, este trabalho visa obter frações ricas em compostos fenólicos de folhas de M. caesalpiniifolia, ativas contra o nematoide Haemonchus contortus.

Material e métodos

O preparo do extrato e o teste anti-helmíntico foram realizados no Laboratório de Controle de Parasitos (LCP), localizado no Centro de Ciências Biológicas e da Saúde (CCBS) da Universidade Federal do Maranhão (UFMA). O fracionamento e a análise por HPLC/UV-Vis foram executados no Laboratório de Química de Produtos Naturais (LQPN), localizado no Centro de Ciências Exatas e Tecnologias (CCET) da UFMA. O material vegetal (folhas) foi coletado a partir de plantas adultas de Mimosa caesalpiniifolia no Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Maranhão (IFMA), campus Maracanã, São Luís. As folhas foram higienizadas, secas à sombra, trituradas em uma forrageira, moídas em um moinho de facas tipo Willey e peletizadas em uma peletizadora tipo Micro PelletMil 40 kg/h. 500 g de pellet foi extraído com acetona 70% (v/v), sonicado por 20 min em banho-maria, filtrado, concentrado em rotaevaporador, liofilizado e armazenado a 4 °C. 1,54 g do extrato foi dissolvido em 6 mL de metanol 80% (v/v), centrifugado (30.000 rpm; 10 min) e o sobrenadante foi carregado em uma coluna cromatográfica embalada com Sephadex LH-20 (d=1,6 cm; h=40 cm) com metanol como fase móvel. Frações de 7,5 mL foram coletadas e secas. As frações foram dissolvidas em 1 mL de metanol 80% (v/v) e alíquotas de 25 μL foram injetadas a partir de uma coluna Hypersil BDS C-18 (Thermo Electron Corp., Waltham, EUA) protegida por uma pré-coluna (Gemini C-18, Phenomenex, Torrance, EUA) em um cromatógrafo líquido (Shimadzu Co., Kyoto, Japão) composto por um degaseificador DGU-20A5, uma bomba LC-20AT, um controlador de sistema CBM-20A, um detector de rede de fotodiodo SPD-M20A e o software LCsolution. As fases móveis utilizadas foram ácido fórmico a 0,1% em água (A) e em metanol (B) em um gradiente exploratório variando de 5% a 100% de B em 60 minutos a um fluxo de 1,0 mL/min. A temperatura da coluna foi mantida em 25 °C e o espectro UV-Vis foi monitorado em 254 nm. Com base nos picos recorrentes entre as frações e na identificação dos grupos químicos presentes, essas foram agrupadas e secas. A identificação dos grupos químicos foi feita a partir da comparação dos tempos de retenção e espectros de UV com dados da literatura. As frações agrupadas foram diluídas em Tween 80 a 1,5% (v/v) e testadas conforme Bahuaud et al. (2006) contra larvas de terceiro estágio (L3, infectantes) de Haemonchus contortus. O desembainhamento artificial foi iniciado por contato com solução de hipoclorito de sódio a 2,0% (w/v), interrompido em 0, 20, 40 e 60 min pela adição de solução de iodo de Lugol e larvas embainhadas e desembainhadas foram contadas usando um microscópio invertido (Axio Vert, Zeiss, Oberkochen, Alemanha). O teste foi realizado em quadruplicata. Para obtenção da concentração inibitória mediana (CI₅₀), os dados foram transformados em log (x), normalizados e foi feita a regressão não linear a partir do software GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Inc., San Diego, EUA).

Resultado e discussão

A partir do fracionamento do extrato de folhas de M. caesalpiifolia em coluna de Sephadex LH-20 obteve-se 63 frações. Com a análise destas por HPLC/UV Vis e análises dos espectros na região do UV, foi possível obter 4 grupos principais de frações (FRA-1, FRA-2, FRA-3 e FRA-4). O grupo de frações FRA-1 apresentou perfis característicos de tanino hidrolisável (Figura 1a), enquanto o grupo FRA-2 apresentou característica de taninos condensados (Figura 1b). As últimas, em que foram detectados picos de menor absorbância, foram divididas e agrupadas em FRA-3 e FRA-4 (Figura 1c e 1d, respectivamente). A atividade in vitro contra H. contortus foi avaliada por um ensaio de inibição do desembainhamento larval a partir de larvas de terceiro estágio (L3) do nematoide. Esse teste apresenta vantagens em relação a outros bioensaios por ser sensível, reprodutível e relevante para processos que ocorrem in vivo. Além disso, prevenir a perda da bainha em larvas de H. contortus quebra o ciclo de vida larval (BAHUAUD et al., 2006) e não permite o estabelecimento de uma infecção no hospedeiro (SOARES et al., 2015). A amostra FRA-2 inibiu, mesmo na menor concentração testada, o desembainhamento larval (Figura 2a), com IC₅₀ de 0,21 mg.mL^-1 (IC_95% = 0,20 – 0,23; R² = 0,98). A amostra FRA-1 também inibiu o desembainhamento larval, porém em concentrações mais altas (Figura 2b), com IC₅₀ de 0,81 mg.mL^-1 (IC_95% = 0,72 – 0,92; R² = 0,93). Em contraste, a maioria das larvas desembainharam mesmo na maior concentração testada quando o tratamento foi feito com FRA-3 e FRA-4 (Figura 2c e 2d), não apresentando dessa forma uma atividade anti-helmíntica relevante o que, certamente, está atrelado ao fato dessas frações serem agrupamentos das últimas alíquotas coletadas na gel filtração o que indica que os compostos fenólicos responsáveis pela atividade já haviam sido eluidos nas frações anteriores. Sabe-se que taninos de diferentes plantas apresentam atividade contra nematoides já relatada tanto in vitro quanto in vivo (CENCI et al., 2007; DEBELA et al., 2012; ENGSTRÖM et al., 2016; KARONEN et al., 2020; LIMA et al., 2019). O modo de ação dos taninos contra nematoides gastrointestinais permanece amplamente debatido, com duas hipóteses geralmente apontadas (ATHANASIADOU et al., 2001; HOSTE et al., 2006; KAHN; DIAZ-HERNANDEZ, 1999; MARTÍNEZ-ORTÍZ-DE-MONTELLANO et al., 2010). A primeira sugere que os taninos são capazes de formar complexos e criar interações com proteínas do parasito, sendo apoiada pela maioria dos resultados in vitro e por alguns estudos in vivo de curto prazo (ATHANASIADOU et al., 2001; TZAMALOUKAS et al., 2006). Por outro lado, a segunda hipótese sugere que os taninos podem afetar indiretamente a biologia do nematoide por meio de uma melhora na resposta imune do hospedeiro (HOSTE et al., 2006; KAHN; DIAZ-HERNANDEZ, 1999). Nessa perspectiva, tendo como espécie alvo do estudo a M. caelsapiniifolia, Brito et al. (2017) demonstrou que o extrato cetônico de suas folhas tem uma significativa atividade sobre o desembainhamento de uma mistura de larvas de H.contortus e Trichostrongylus colubriformis com CI₅₀ de 0,684 mg.mL^-1. Efeito esse que foi atribuído a presença de uma considerável quantidade de taninos e, mais especificadamente, de taninos condensados devido o extrato com polivinilpolipirrolidona (PVPP), composto utilizado como inibidor de taninos e glicosídeos de flavonóis (ALONSO-DÍAZ et al., 2008; DONER; BECARD; IRWIN, 1993), não ter apresentado atividade in vitro. Em concordância, FRA-2, que é o agrupamento de frações com picos indicativos de taninos condensados (Figura 1b), apresentou a maior atividade dentre as frações testadas, com uma CI₅₀ cerca de três vezes menor do que a obtida por Brito et al. (2017) para o extrato bruto. No entanto, o PVPP também é capaz de se ligar e inativar outros vários polifenóis (ALONSO-DÍAZ et al., 2008; BARRAU et al., 2005; MENGISTU et al., 2017), incluindo ácidos fenólicos e seus derivados. Os ácidos fenólicos são as unidades básicas de taninos hidrolisáveis e, embora tenham sido pouco investigados quanto a atividade anti-helmíntica, já foram apontados em estudos anteriores como tendo essa atividade (GAO et al., 2018; LOPES et al., 2018; NDJONKA et al., 2014; PEGARD et al. , 2005; SANTHI et al., 2019). Entre esses, o ácido gálico, o elágico, o gentísico, o vanílico, o felúrico, o salicílico, o cinâmico e o clorogênico são alguns dos compostos mencionados como anti-helmínticos. Já seus derivados como derivados simples do ácido gálico, galotaninos e elagitaninos, que são taninos que não têm sido tão exaustivamente estudados quanto os condensados, também já demonstraram ter atividade anti-helmíntica, inclusive contra o H. contortus (ENGSTRÖM et al., 2016; KARONEN et al., 2020). Assim, corroborando com esses trabalhos, a amostra FRA-1, que é o agrupamento das frações com um pico indicativo de tanino hidrolisável, derivado de ácido fenólico, demonstrou ter atividade anti-helmíntica, porém com uma CI₅₀ maior do que a obtida para o extrato bruto por Brito et al. (2017). Todavia, novos estudos devem ser realizados para verificar detalhadamente quais moléculas de fato estão atuando contra o desembainhamento do Haemonchus contortus nas frações bioativas.

Conclusões

A partir do presente estudo é possível inferir que frações enriquecidas com polifenóis obtidas do fracionamento do extrato de folhas de Mimosa caesalpiniifolia apresentam bioatividade e o potencial do extrato bruto pode estar associado tanto a taninos condensados como hidrolisáveis. Somado a isso, foi confirmado o potencial promissor do uso da M. caesalpiniifolia como fonte de compostos fenólicos com atividade contra Haemonchus contortus, uma vez que as frações agrupadas e identificadas como bioativas demonstraram ter uma alta eficiência na inibição da perda da bainha em larvas infectantes desse nematoide, com concentração inibitória mediana (CI50) abaixo de 1 mg.mL-1.

Agradecimentos

Agradecemos à FAPEMA, CNPq, CAPES, FINEP e IFMA.

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