Autores
Díaz, K. (UNIVERSIDAD TECNICA FEDERICO SANTA MARÍA) ; Perez-matas, E. (UNIVERSIDAD DE BARCELONA) ; Escrich, A. (UNIVERSIDAD DE BARCELONA) ; Chavez, M.I. (UNIVERSIDAD DE VALPARAISO) ; Espinoza, L. (UNIVERSIDAD TECNICA FEDERICO SANTA MARÍA) ; Palazon, J. (UNIVERSIDAD DE BARCELONA)
Resumo
No existen reportes sobre el efecto de Brasinoesteroides (BRs) como elicitores
en la producción de taxanos y su vía biosintética en cultivos celulares de Taxus
sp. Por ello, el objetivo de este trabajo fue determinar el efecto de BRs
(Brasinólido [1] y un análogo de BRs [2])como elicitores sobre la producción de
taxanos en suspensiones celulares de T. media. Además, se analizaron los niveles
de expresión de 3 genes (TXS, BAPT, DBTNBT) implicados en la biosíntesis de
taxanos para correlacionar los cambios moleculares y la producción de taxanos.
Los genes analizados durante 3 días después de la elicitación demuestran que
existen una inducción variable dependiendo del tiempo de elicitación y la
concentración del elicitor; resultando la producción de taxanos mejorada por la
aplicación de BRs.
Palavras chaves
análogo de brasinoesteroi; taxanos; elicitor
Introdução
La producción de metabolitos secundarios mediante el cultivo de células
vegetales in vitro ha sido ampliamente estudiada (ESPINOSA-LEAL et al., 2018)
principalmente en aquellas plantas de interés farmacológico e industrial. El
taxol® (nombre genérico paclitaxel) es un alcaloide diterpenico que posee
actividad antitumoral sobre distintos tipos de cáncer, su fuente natural es la
corteza de varias especies de Taxus sp, sin embargo, se encuentra a bajas
concentraciones y su extracción desde la planta silvestre ha dejado a varias
especies en peligro de extinción para cumplir la demanda. Es por ello, que el
cultivo de células vegetales adicionando elicitores se ha convertido en una
alternativa prometedora para la producción y liberación de Taxol y otros taxanos
(SABATER-JARA et al 2014; PEREZ-MATAS et al 2022). Sin embargo, no existen
estudios sobre el efecto de Brasinoesteroides naturales y sintéticos como
elicitores en este tipo de plantas, estos reguladores del crecimiento vegetal
poseen una serie de propiedades sobre la fisiología de las plantas (NOLAN et al
2020; DÍAZ et al., 2021), por lo cual podrían promover la acumulación y
liberación de ciertos metabolitos secundarios en su biosíntesis. El objetivo de
este trabajo fue determinar el efecto de BRs (Brasinólido [1] y un análogo de
BRs [2]; Figura 1) como elicitores sobre la producción de taxanos en
suspensiones celulares de T. media. Adicionalmente, se analizaron los niveles de
expresión de 3 genes (TXS, BAPT, DBTNBT) implicados en la biosíntesis de taxanos
para correlacionar los cambios moleculares y la producción de taxanos.
Material e métodos
Para este estudio, se establecieron cultivos celulares a partir de callos
elicitados de T. media con distintos tratamientos de BRs (Brasinolide a 0.01
µM y 0.1µM; análogo de BRs a 0.01 µM y 0.1µM) en un medio optimizado de
crecimiento durante 14 días con su respectivo tratamiento control sin aplicación
de elicitor y un tratamiento control con un elicitor conocido Jasmonato de
metilo (MeJA), posteriormente fueron traspasados a un medio optimizado para la
producción de taxanos con la adición al medio de cultivo de los mismos
tratamientos de BRs aplicados en los callos. Las muestras para la extracción de
los cincos taxanos (10-deacetilbacatina (DAB), Bacatina III (BIII),
Deacetiltaxol (DT), Cefalomanina (CF) y Taxol (TX) fueron tomadas desde el medio
de cultivo y células liofiliozadas a las 0, 8 y 16 días de iniciado el ensayo
según lo descrito por ONRUBIA et al., 2013 y cuantificados mediante el método de
Cromatografía Liquida de Alta Resolución con detector de arreglo de Diodos
(HPLC-DAD) descrito por RICHHEIMER et al., 1992). El análisis de expresión de
genes TXS, BAPT y DBTNBT se determinó mediante qRT-PCR utilizando SYBR Green
Mastermix (Biorad, Hercules, CA, Estados Unidos) en un sistema de plataforma de
384 pocillos (LightCycler®480 Instrument, Roche, Estados Unidos). Las muestras
fueron tomadas a las 0, 12, 24 y 48 horas. Los datos se analizaron con
LightCycler® v4.1. El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando Excel.
Todos los datos relativos a la biomasa, cuantificación de taxanos y perfiles de
transcripción se expresaron como la media de tres determinaciones independientes
± desviación estándar (SD). Para las comparaciones estadísticas se utilizó el
análisis ANOVA multifactorial seguido de las pruebas de comparación múltiples de
Tukey
Resultado e discussão
La capacidad de producción de biomasa de los callos de T. media para el control
fue constante logrando una biomasa final 0.5 veces mayor a la del inóculo
inicial, a diferencia de los cultivos elicitados por ambos BRs (Figura 1) que no
presentaron una influencia marcada en el crecimiento de biomasa, lo cual se
puede explicar debido a la producción de taxanos que podrían alteran el
crecimiento celular (KIM et al., 2004). Sin embargo, la producción total de
taxanos en la suspensión celular (extracelular) aumentó significativamente con
la aplicación de Brasinólido [1] (0.01 µM) logrando un nivel máximo de 20 veces
más (día 8) en comparación al tratamiento control (día 8) y 3 veces más al
control con Jasmonato de metilo (MeJA) (día 8); en el medio intracelular de las
suspensiones celulares ambos brasinoesteroides [1 y 2] inducen una respuesta de
producción de taxanos totales similar a la del elicitor MeJA a los 8 días de
iniciado el experimento, por lo cual se confirma su rol de elicitor en
comparación al control. Los genes analizados durante 3 días después de la
elicitación demuestran que existen una inducción variable dependiendo del tiempo
de elicitación y la concentración del elicitor. El gen TXS se ve claramente
potenciado por la aplicación de los BRs [1 y 2], la diferencia de genes
transcritos en los tratamientos de BRs fue significativamente mayor a las 72
horas tanto para el análogo de BRs a la mayor concentración (0.1 µM) como para
el Brasinólido [1] a la menor concentración con respecto a los controles. A
diferencia de la expresión relativa en el caso de BAPT que no se ve mayormente
afectada. No obstante, existe una correlación entre el patrón de expresión
observado para el DBTNBT y la mayor cantidad de taxol producida en los cultivos
celulares.
Brasinoesteroides ensayados Brasinólido [1]; análogo de Brasinoesteroide 3,22(S),23-trihidroxi-24-nor- 5-colan-6-ona [2].
Conclusões
En conclusión, los brasinoesteroides pueden actuar como elicitores duplicando la
producción de paclitaxel en comparación al elicitor MeJA en el medio extracelular,
y 26 veces mayor en el medio intracelular de T. media. La adición de este tipo de
elicitores en los cultivos celulares influye principalmente en la expresión de
genes TXS y DBTNBT obteniendo una acumulación de mRNA alta a las 72 horas de
elicitación.
Agradecimentos
(1)Becas Santander Movilidad Internacional de Profesores; Banco Santander Chile.
2022.(2) Proyecto Interno de Investigación “Línea Regular” PI-LIR-2021-80, DGIIE-
UTFSM. (3) Dr. Palazón y Dra. Cusidó, Universidad de Barcelona.
Referências
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