Estado de protonación de la enzima DPP4: efecto en el reconocimiento del inhibidor Vildagliptina

Autores

Corredor, J. (UNAB) ; Jaña, G. (UNAB) ; Jimenez, V. (UNAB)

Resumo

Se evaluó el efecto de los estados de protonación de los residuos His126, Asp663 y Asp709, cercanos al sitio activo de la enzima DPP4, en el reconocimiento del inhibidor VIL. El estudio se realizó mediante cálculos de dinámica molecular MD, cálculos MM/GBSA y análisis Hbond para determinar la formación de enlaces de hidrogeno. Se estableció que el sistema con His126 protonada en épsilon y los residuos Asp protonados favorece el reconocimiento de VIL. En esa configuración VIL se posiciona tal como en la estructura cristalina y se generan enlaces de hidrogeno con los residuos considerados de reconocimiento, coincidiendo con lo planteado en el mecanismo de reacción.

Palavras chaves

DPP4; Vildagliptina; Dinamica molecular

Introdução

La diabetes mellitus (DM) es una enfermedad metabólica crónica considerada un problema de salud pública debido a su alta prevalencia. Esta enfermedad se manifiesta por una elevada concentración de glucosa en la sangre durante un tiempo prolongado, debido a la deficiencia relativa o absoluta de la hormona insulina, ocasionando complicaciones multisistémicas en el organismo (BILOUS et al 2021). Se estima que 463 millones de personas entre 20-79 años padecen DM en el mundo, proyectándose una cifra de 700 millones para el año 2045 (BILOUS et al 2021; ZHENG et al., 2018). Dependiendo de los factores que generan la enfermedad, existen diferentes tipos de diabetes. Las formas más comunes y con mayor impacto en la salud publica son la diabetes tipo 1 (DM1) y diabetes tipo 2 (DM2), siendo ésta última la de mayor prevalencia con aproximadamente el 90% de casos (BILOUS et al 2021). En el caso de DM2 se han desarrollado múltiples tratamientos enfocados en diferentes dianas farmacológicas que participan en la liberación de la insulina y en el metabolismo de carbohidratos (DIABETES CARE, 2021). Entre estos se encuentran los inhibidores de la enzima dipeptidil peptidasa-4 (DPP4, EC 3.4.14.5), principal reguladora de la disponibilidad de péptido 1 tipo glucagón (en inglés Glucagon-Like Peptide-1, GLP-1) y péptido insulinotrópico dependiente de la glucosa (en inglés Glucose-dependent Insulinotropic Peptide, GIP) en el organismo (DRUCKER et al, 2006; KIM et al, 2008). Esta enzima exopeptidasa reconoce los aminoácidos alanina en la penúltima posición del sustrato e hidroliza el enlace peptídico correspondiente suprimiendo su actividad insulinotropica (KIM et al, 2008; SEINO et al., 2010). Por esta razón, la inhibición de DPP4 implica un aumento en la disponibilidad de GLP-1 y GIP, promoviendo la secreción de insulina en el páncreas y reduciendo la hiperglicemia en personas afectadas por DM2. En la actualidad existe un número importante de inhibidores de DPP4 que se administra en tratamientos para esta enfermedad con un mínimo de efectos secundarios, lo que le confiere primacía frente a los tratamientos dirigidos a otras dianas farmacológicas (DIABETES CARE, 2021; KUMAR et al., 2021). Además, estudios recientes relacionan la DPP4 con la infección por SARS-CoV-2 (COVID-19) debido a su papel como segundo receptor del virus y su rol en procesos inflamatorios en el pulmón, incrementando el interés en el desarrollo de fármacos inhibitorios (DRUCKER, 2021; SOLERTE et al., 2020). La enzima DPP4 es una proteína transmembrana que principalmente se presenta formando estructuras diméricas ancladas en la superficie celular o disuelta en el plasma. La estructura está compuesta los dominios α/β hidrolasa y β- helicoidal con la cavidad catalítica localizada en medio de los dominios (AERTGEERTS et al, 2004; KLEMANN et al., 2016; LAMBEIR et al., 2003; RÖHRBORN et al., 2015). La enzima presenta una triada catalítica del tipo nucleófilo-acido- base, compuesta por los residuos Ser630, Asp708 e His740 (LAMBEIR et al., 2003). En la reacción enzimática, el sustrato se enlaza covalentemente a través del ataque nucleofílico de la Ser630 sobre el sustrato, formando un intermediario tetraédrico que conduce a la ruptura del enlace peptídico (MATTEUCCI & GIAMPIETRO, 2009). Los inhibidores covalentes siguen el mismo mecanismo debido a que su estructura es similar a la del sustrato. Algunos inhibidores presentan un anillo de pirrolidina (análoga a la prolina) con un grupo nitrilo en posición 2, el cual reacciona con la Ser630 formando el complejo covalente imidato de enzima (KUMAR et al., 2021). Vildagliptina es un inhibidor covalente de la enzima DPP4, potente y selectivo, sintetizado en 2003 (VILLHAUER et al., 2003). Dadas sus propiedades farmacocinéticas, biodisponibilidad y bajo potencial de interacción con otros medicamentos y alimentos, este fármaco es considerado eficaz, seguro y bien tolerado (HE, 2012). Actualmente se utiliza para el tratamiento de diabetes tipo 2, solo y en combinación con otros fármacos antidiabetes. En una investigación reciente se ha propuesto un mecanismo de inhibición de VIL y su análogo Saxagliptina, incrementando el interés en la comprensión de los detalles fisicoquímicos implicados en el reconocimiento de los fármacos y la inhibición de esta enzima (WANG et al., 2019). También se ha demostrado que la velocidad de unión de los inhibidores catiónicos como VIL es influenciada por fuerzas culombicas atractivas, las cuales además definen el perfil de reacción y las barreras energéticas asociadas (PAN et al., 2013; SCHNAPP et al., 2016). Por esta razón, en esta investigación hemos determinado el estado de protonación más probable para los residuos ácidos y básicos que se encuentran en la cavidad catalítica de la enzima DPP4 a través de Dinámica Molecular.

Material e métodos

Construcción del sistema La estructura cristalográfica del complejo DPP4/VIL (6B1E, resol. 1,77 Å) está disponible en el Protein Data Bank (PDB) (BERGER et al., 2018). Los estados de protonación de los residuos ácidos y básicos se determinaron a pH fisiológico de 7,4 utilizando el servidor H++ (ANANDAKRISHNAN et al., 2012). La tríada catalítica de estado de reactivo se fijó como SER-HID-ASP y los diferentes estados de la proteína se obtuvieron cambiando la protonación de los residuos His126, Asp663 y Asp709. El reactivo VIL se reconstruyó a partir de la estructura cristalina 6B1E y se parametrizó usando el programa Antechamber con cargas obtenidas al nivel AM1-BCC. Mediante el programa LEAP se obtuvieron los complejos proteína-inhibidor, neutralizados con iones Na+ o Cl-, y solvatados en una caja octaédrica periódica con moléculas de agua OPC. Los complejos se mantuvieron sumergidos a 10 Å desde el borde de la caja. Dinámica molecular clásica Los campos de fuerza ff19SB5225 y GAFF se implementaron para modelar las estructuras de la proteína y de VIL. Las simulaciones de MD se realizaron con el programa pmemd.CUDA incluido en AMBER20 (CASE, et al 2021). Se implementó el método PME (Particle Mesh Ewald) para evaluar interacciones no covalentes hasta un máximo de 10 Å. Todos los enlaces que incluyen hidrógeno se restringieron utilizando el algoritmo SHAKE. El procedimiento para realizar las simulaciones MD convencionales consistió en a) 1500 pasos de minimización descendente seguidas de 3500 ciclos de minimización por gradiente conjugado, para la caja de agua con el complejo restringido; b) 1.500 ciclos de minimización descendente, seguidos de 6.500 ciclos de minimización del gradiente conjugado para todo el sistema; c) 500 ps de calentamiento NVT de 0 a 300K; d) 500 ps de equilibrado del sistema NVT; e) equilibrado NPT sin restricciones durante 20 ns a 300 K y f) 150 ns de dinámica de producción NPT sin restricciones a 300 K y 1 bar de presión, con tiempos de integración de 2 fs. Este protocolo ha sido previamente validado para el estudio de otros sistemas proteína-ligando (JIMÉNEZ et al., 2021). Los análisis de trayectorias se realizaron utilizando el software CPPTRAJ y VMD (HUMPHREY, et al 1996). La herramienta Hbond se utilizó para determinar los enlaces de hidrógeno formados. Las energías de enlace se calcularon utilizando el método MM/GBSA.

Resultado e discussão

La secuencia de la enzima DPP4 humana se alineó con la estructura Uniprot P27487 con lo que se verificó que la estructura 6B1E no posee discontinuidades, solamente presenta una mutación en el primer residuo (extremo N-terminal, residuo 39) y por tanto la estructura es representativa de la enzima DPP4. Teniendo en cuenta que se trata de una proteína homodimérica con actividad catalítica independiente, se seleccionó uno de los monómeros y se determinó el estado de protonación más probable a pH 7.4. En la cavidad catalítica de la enzima se encuentran los residuos catalíticos Ser630, His740, Asp708 y Tyr547. De igual forma se localizan los residuos ácidos y básicos: His126, Asp663, Asp709, Asp739, His712 e His704 como se muestra en la Figura 1a. Los valores de pKa calculados a pH fisiológico para los residuos His126, Asp663, Asp709 son particularmente relevantes porque podrían no ser descritos correctamente por las aproximaciones de H++. Con el fin de determinar el estado de protonación más probable para los residuos mencionados, se prepararon los complejos con las distintas combinaciones posibles para determinar la configuración que favorece el reconocimiento de VIL en el sitio activo (Figura 1b). Las dinámicas moleculares clásicas permitieron seleccionar los sistemas con el mejor comportamiento en las cuales el inhibidor se mantiene durante más tiempo en interacción con el sitio activo. Solamente seis de las configuraciones estudiadas conservaron el ligando dentro de la cavidad catalítica y presentan los menores valores de RMSD promedio (Figura 2a). Los valores RMSD calculados han sido referenciados respecto a las posiciones atómicas de la estructura cristalina por lo cual su valor es una medida relativa de la permanencia del inhibidor en el sitio activo. Como se puede observar en la Figura 2b, de estos seis sistemas, los sistemas 2, 3 y 8 presentan menores valores de RMSD con la menor variabilidad. En la reacción de inhibición covalente, el ataque nucleofílico de Ser630 sobre el carbono del grupo nitrilo de VIL es el paso determinante de la reacción, por lo tanto, la distancia que existe entre el residuo y el inhibidor define la probabilidad de llevar a cabo la reacción. En la Figura 2c se muestran los histogramas de frecuencia para la distancia Ser630-VIL medida entre los átomos de Oxígeno y Carbono respectivamente. Para el sistema 8, la mayor frecuencia se presenta para la distancia de 3-3.5 Å, con una diferencia contundente frente a los otros sistemas. El análisis de los datos por prueba t-student a dos colas, permite confirmar que el sistema seleccionado es estadísticamente diferente a los demás, con un nivel de confianza del 95%. Los cálculos de energía libre de unión a través de la aproximación MM/GBSA (Figura 2d), muestran que el sistema 8 presenta el menor valor de energía y por tanto es el sistema en el que el ligando genera interacciones más efectivas. La tendencia de valores de energía respecto a la configuración del sistema permite identificar que la protonación del residuo Asp663 contribuye significativamente en el reconocimiento del inhibidor, dado que cinco de los seis sistemas implican esa configuración. De igual forma, por la descomposición de los valores de energía se pudo determinar que el incremento en la energía libre del sistema 8 es de naturaleza electrostática y no de dispersión de Van der Wals. Por otra parte, la estructura cristalina del complejo DPP4/VIL, presenta distancias entre el grupo amino de VIL y los residuos Glu205 y Glu206 del orden de magnitud de los enlaces de hidrogeno. Esto también se observa entre el grupo carbonilo y el residuo Asn710, sugiriendo que son interacciones relevantes en el reconocimiento del inhibidor. El análisis Hbond de las trayectorias de los sistemas 2, 3, 7 y 8 permitió establecer que únicamente en el sistema 8 se presentan todas las interacciones mencionadas (Figura 2e). Esto indica que en dicho complejo el inhibidor presenta el mejor posicionamiento en la cavidad catalítica, muy similar a la estructura de los productos generados en la reacción.

a) Residuos catalíticos (naranja) y residuos acidos y básicos (colores) b) Estados de protonación explorados. c) Estados de protonación de His y Asp.


a) RMSD de los sistemas evaluados. b) Histogramas de frecuencia RMSD. c) Histogramas distancia Ser- VIL. d) Energía libre de unión MMGBSA. e) Frecuencia de formación de enlaces de hidrogeno.

Conclusões

Se estableció que el sistema 8, con His126 protonada en épsilon y los residuos Asp663 y Asp709 protonados, favorece el reconocimiento de VIL. En esa configuración VIL se posiciona tal como en la estructura cristalina y se generan enlaces de hidrogeno con los residuos considerados de reconocimiento. La energía libre de unión para ese sistema es considerablemente mayor, lo que sugiere una mejor interacción del ligando con el sitio catalítico, coincidiendo con lo planteado en el mecanismo de reacción.

Agradecimentos

A la Republica de Chile. Al programa de Doctorado en Fisicoquimica Molecular de la Universidad Andres Bello de Chile. A la Agencia Nacional de investigación y desarrollo ANID.

Referências

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